生物
薬剤師国家試験 第106回 問113
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検体中における、ある微生物の存在を調べるために、リアルタイム PCR 法を 実施した。以下に示す測定手順で行い、測定した結果を図に示す。この実験に関す る記述のうち、正しいのはどれか。2つ選べ。 測定手順 3 つの検体(試料 1 ~ 3 )をサンプルチューブに別々に採取し、それぞれに DNA 抽出用の試薬を加える。 ↓ 抽出した DNA を定量する。 ↓ 各検体から一定量の DNA を別々のチューブに取り、それぞれのチューブに二本 鎖 DNA を検出する蛍光色素、デオキシヌクレオチド混合物、プライマー 1 組、 酵素を含む反応液を加えて、PCR を開始する。 ↓ 蛍光強度を測定することで、反応産物が増幅されていく経過を追いながら、PCR を約 40 サイクルまで繰り返す。 25 試料 1 試料 2 試料 3 度強光蛍 閾値* 10 20 23 26 30 サイクル数 *閾値:設定したある蛍光強度の値
正解と解説
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正解 4, 5
各試料とも 25 サイクルを超えるあたりから曲線が頭打ちになる主な原因は、デオキシヌクレオチドが枯渇するためである。 / PCR 開始時に反応液に加える酵素には耐熱性のものを用いる。26
リアルタイムPCRでは反応液中のdNTPなどの基質が消費されて枯渇することがサイクル後半で増幅曲線が頭打ちになる主な要因の一つであり、また高温での変性ステップを繰り返すためTaqポリメラーゼなど耐熱性の酵素を用いる必要がある。この測定手順はDNAを鋳型として直接増幅するものであり、逆転写の工程を含まないためRNAウイルスの検出にはそのままでは対応できない。